这些技术为临床分子诊断手段的发展提供了源源不断的动力和无限的想象空间,并在应用中不断地成熟,使得临床分子诊断成为检验医学最有活力一个的领域,是当今个体化医疗迅速发展的支撑,其具体表现形式就是各种用于特定疾病诊断和治疗的临床分子诊断试剂。

引言

一提到分子诊断，人们自然会想到核酸和基因。的确，分子诊断技术的发展与分子生物学的研究是分不开的，自1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构以来，一系列分子生物学新技术相继出现，如Sanger测序、放射性核素和非放射性核素标记技术、电泳、层析、核酸纯化、核酸液相和固相杂交、基因工程技术、限制性酶切、聚合酶链反应(PCR)技术、毛细管电泳、实时荧光PCR、基因芯片、质谱、新一代测序等。这些技术为临床分子诊断手段的发展提供了源源不断的动力和无限的想象空间，并在应用中不断地成熟，使得临床分子诊断成为检验医学最有活力一个的领域，是当今个体化医疗迅速发展的支撑，其具体表现形式就是各种用于特定疾病诊断和治疗的临床分子诊断试剂。

一、历史

我国的临床分子诊断试剂的出现，最早可以回溯到上世纪80年代，较国外晚10年左右，当时国外主要用于遗传病的诊断，我国则主要用于乙型肝炎等传染病的检测，这与我国人群乙型肝炎病毒(hepatitisB virus，HBV)的感染率高，乙型肝炎患者较多是分不开的。那时，主要是采用硝酸纤维素膜上斑点杂交方法，探针采用32P标记，杂交完成后，通过放射自显影显示结果，后来，逐步发展到采用生物素或地高辛等非同位素标记。

上世纪90年代以前，在我国涉及乙型肝炎治疗的医院临床实验室应用核酸斑点杂交检测HBVDNA相当普遍。斑点杂交技术的特点是简单方便，但检测敏感性低，今天看来，将其用于对检测灵敏度要求较高的病原体的检测并不合适。

1983年，美国Cetus公司的Mullis发明了PCR技术，其利用DNA高温变性和低温复性的基本原理，通过变性、复性和延伸3个温度变化，成功实现了DNA在体外的复制。但该技术最初由于每一扩增循环均需加入DNA聚合酶(因其不耐热)，实际应用受到限制，成为PCR应用于疾病诊断的瓶颈，随后几年，该公司成功从美国黄石国家公园温泉中分离到的嗜热菌中得到了耐热的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)，

1989年被美国Science杂志命名第一个“年度分子”使PCR临床应用的瓶颈问题迎刃而解，从而使得PCR成为临床分子诊断和生命科学研究中的一个革命性技术，预示着分子时代的到来。因此到90年代初期，国内一批研究人员迅即将这一技术用于HBV的临床检测，出现一大批生产PCR试剂的公司，采用的基本技术是PCR-琼脂糖凝胶电泳方法，靶核酸经PCR扩增后，会出现一定长度片段的特异扩增产物，电泳分离后，经溴化乙啶染色，紫外线下可见相应的分子大小的条带。

到90年代中期，又有一些厂家，生产了PCR-板上杂交即PCR-酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。但由于PCR-琼脂糖凝胶电泳和PCR-ELISA均为PCR后有一个开管取扩增产物进行分析的过程，极容易出现扩增产物被“污染”所致的假阳性结果，临床反映强烈，直接导致1998年4月卫生部下文暂停了PCR检验在临床中的应用。其实在90年代中期，国内一些企业已意识到这种假阳性带来的问题，开始研发实时荧光PCR检测试剂，并用于临床检测。

二、现状及问题

临床检验的发展方向无疑是自动化，临床分子诊断亦是如此。自动化带来了“检测系统”的概念，即检测仪器、试剂和校准品的一体化，从而避免了同一试剂在不同实验室配不同仪器所带来的结果不确定的问题，但由于我国整体工业水平(尤其是原材料工业和精密加工工业)与西方发达国家的差距，在国产仪器设备的基础实现临床检验的自动化尚需时日，临床分子诊断尤甚。因此，目前我国的临床分子诊断在核酸提取、扩增反应液准备、扩增前加样、上机、产物分析和结果分析报告等方面仍是以手工操作为主。

分子诊断中繁杂且要求精细的手工操作步骤，使得临床实验室工作人员总在不断追求操作步骤简单的试剂，试剂生产厂家为满足用户的这种需求，也在努力追求操作简单化，于是一些只需要简单核酸提取或不需核酸提取、最少试剂配制的检测试剂应时而生。如目前在国内广泛使用的HBVDNA实时荧光PCR试剂。任何一件产品，如果生产过程只是追求简单，则一定会以质量下降为代价。因此，国内的用于传染病检测的PCR试剂如HBV DNA、丙型肝炎病毒RNA(HCVRNA)和人类免疫缺陷病毒-1RNA(HIV-1 RNA)定量检测，与国外同类试剂盒相比较，一直存在重复性、分析敏感性和抗干扰(溶血、黄疸、脂血等)能力差等问题[1，2，3]。存在这些问题的最根本原因主要在于核酸提取，荧光PCR扩增阶段的试剂水平与国外并无太大差距。临床标本中可能存在血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、胆红素、血脂等均是PCR扩增反应的抑制剂，是否能有效地将这些抑制物从标本中去除，决定了后续 的PCR扩增效率。核酸提取方法过于简单，则无法将这些抑制物有效去除，直接影响后面的扩增检测结果，影响上述检测性能。而且，也因为这些抑制物的存在，无法在扩增检测时加大样本加入量。样本加入量小，一是加样的重复性和准确性都相对较差，最后会反映在整个检测的重复性差;二是直接影响分析敏感性。作为PCR扩增来说，从理论上讲，每个反应管内至少有1个分子，才会出现扩增，加样量少，在标本内相应靶核酸含量少的情况下，则取得1个以上靶分子的可能性也小，反之越大。相对于传染性病原体核酸检测来说，人的基因检测试剂在上述方面问题相对较少，因为人的基因含量高，一般不存在因标本中基因组含量少而影响检测敏感性的问题，通常的核酸提取方法均可达到相应要求。

近年来，随着药物基因组学和肿瘤靶向治疗等的研究进展，与个体化治疗用药相关的基因多态性、基因突变和基因量的变化等的检测正迅速走向临床应用。国内众多厂家正在采用各种方法开发商品试剂，如基于实时荧光PCR的方法、PCR-杂交(硝酸纤维素膜、乳胶颗粒如Luminex、玻片如基因芯片等)、PCR-测序(双脱氧测序、焦磷酸测序、新一代测序如Illumina、Iontorrent等)和PCR-高分辨熔点曲线分析(HRM)等，技术多种多样，各有特点，有的对实验室分区和操作人员的要求较高，对广大基层实验室来说，较难实际应用。因此，作为临床实验室如何判断一种试剂方法能否有效地用于日常检测，最重要的是在自己实验室条件，对相应的试剂方法进行性能验证，主要的性能指标有重复性、准确性、特异性、检测限和抗干扰能力等，这些性能指标中最重要的是重复性，其是准确性的前提。评价重复性的1个简单方法是，选择不同强弱阳性及阴性的数份样本进行20次批内和批间测定，看是否能得到相同的结果。如否，需寻找原因，排除实验室环境条件及人员操作的因素，如果确认属于试剂或方法的问题，则该试剂或方法就不具备临床实用性，不能用于临床检测。

三、展望

随着对人类基因及其结构改变、基因表达或表达产物代谢异常与疾病的发生、发展和药物作用上的研究进展，分子诊断不只是涉及DNA和RNA，也涉及蛋白组学和代谢组学检测。检测方法学的进步，使得因疾病而改变的基因及其结构改变的谱、基因表达谱(RNA和蛋白谱)、代谢通路上的小分子谱的检测变得容易，将出现一大批可用于临床疾病诊治的分子诊断标志物，使人类对疾病的认识，由点入面，最后得到1个清晰的全景图像，治疗成为有的放矢，使得患者疾病的治疗进入到真正的个体化时代。 由上述可见，实验室检测尤其是分子诊断的准确性对于个体化医学时代患者疾病的诊治的重要意义。

1.方法学的更新换代

尽管在国内外文献上发表的分子诊断方法很多，并且还在不断出现，也有不少人尝试将用于临床诊断，但随着时间的推移，一些在临床实际检测中证明重复性不好的只适用于科研的方法，将会被完全淘汰。有些方法，在对操作者有严格训练的情况下，可得到好的重复性，但很难广为推广应用，只适用于个别实验室自配试剂使用。适用于广大基层临床实验室的检测方法，通常应具备以下特征:(1)对实验室的分区要求低;(2)对人员的操作的精确度要求不高;(3)结果分析简单。

2.商品试剂与实验室自配试剂

我国的临床检验由完全的自配试剂进行日常检测进入到依赖商品试剂盒，是从上世纪80年代末开始的，到90年代中后期，实验室基本不再使用自配试剂。分子诊断不同于临检、生化、一般免疫分析等，其日常检测量明显较少，且一些特定的检测项目如遗传病和罕见疾病的分子诊断，病例数更少，这些疾病的分子诊断试剂是永远也不可能有经过批准的商品试剂盒的，因此，就必须允许临床实验室自配试剂进行检测。最重要的是，如果是自配试剂必须有自配试剂的标准操作程序(SOP)，包括从原材料选择及其每批质检、试剂配制、试剂的性能验证(重复性、准确性、特异性、检测下限、抗干扰能力等)、每批试剂质检方法等，最后形成的应是一个非商品试剂盒，从内到外应有商品试剂盒所具备的所有必要成分，并标明有效期。实验室应保存该试剂制备的所有原材料购置、质检和制备的实验记录。用于日常检测时，应有严格的室内质量控制，如有室间质量评价，则应参加，如无，则应有实验室间比对，以保证日常检验的质量。

3.实验室检测的自动化

随着我国基础工业的进步及下游工业的全球化，临床分子诊断的自动化将逐步在国内的临床实验室应用。自动化首先将是在目前手工操作且对结果影响最大的核酸提取上实现，然后是结果的分析判断，这方面软件将起到最为关键的作用。当然最终目标，是实现从核酸提取到扩增检测、结果报告全过程的自动化，国外一些厂家如罗氏、凯杰已实现了这一点，但对于国内企业来说，仍需要一个相当长的时间。

来源：《检验医学》杂志，原标题“我国临床分子诊断试剂发展：问题及思考”。